형광 현미경 이미지는 세포, 구조 및 조직을 더 잘 이해할 수 있게 해주는 도구이지만, 공 초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하면 더 많은 것을 발견할 수 있습니다. 이번 글에서는 공 초점 레이저 스캐닝 현미경 간단한 3단계 관련해서 알아보겠습니다.
Ⅰ. 개요
고해상도 광학 이미징과 깊이 선택성을 결합하여 광학 절편을 수행할 수 있으며 이는 물리적으로 절단하기 어려운 작은 구조(예: 배아)의 시각적 단면을 보고 2D 현미경 사진에서 3D 구조를 구성할 수 있음을 의미합니다.
공 초점 레이저 현미경(CLSM)이 어떻게 작동하는지 작동 원리와 구성 요소를 자세히 살펴보겠습니다.
Ⅱ. 공 초점 레이저 현미경(CLSM)의 기원
공초점 현미경의 원리는 1957년 Marvin Minsky에 의해 특허를 받았지만 레이저 스캐닝 프로세스를 통합하기 위해 완전히 개발되기까지는 몇 년이 걸렸습니다.
이 기술은 기본적으로 초점이 맞춰진 레이저 빔을 사용하여 물체를 하나씩 스캔하여 현미경 사진을 3D로 재구성할 수 있으며, 기존 현미경에서는 빛이 투과할 수 있는 거리까지만 볼 수 있었지만, 공 초점 현미경은 한 번에 한 깊이 수준의 이미지를 촬영합니다.
Ⅲ. 공 초점 레이저 현미경(CLSM)의 응용
그렇다면 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 어떤 용도로 사용할 수 있을까요?
대부분의 과학 분야에서 유용하며, CLSM을 사용하여 연구할 수 있는 표본의 몇몇 분야는 다음과 같습니다.
- 세포 생물학의 세포소기관, 세포골격, 세포막.
- 신경과학에서의 뉴런, 시냅스, 덴드론.
- 발달 생물학의 배아 및 유기체.
- 면역학에서의 면역세포와 병원체.
- 암 연구에서 암 조직과 종양-약물 상호 작용.
- 재료과학 분야의 고분자, 금속, 세라믹.
- 환경 샘플의 오염 물질 분포.
보시다시피 생물학에서만 사용을 하게 될 줄 알았던 분야를 넘어 대부분의 산업 분야에서 유용하게 사용되어 집니다.
Ⅳ. CLSM 작동 방식 3단계
공 초점 레이저 스캐닝 현미경은 광원 조리개를 통해 레이저 빔을 통과시킨 다음 대물렌즈를 통해 샘플 표면의 작은 영역에 초점을 맞추는 방식으로 작동합니다.
이미지는 샘플의 형광단에서 방출된 광자를 수집하여 픽셀별로 구성됩니다.
CLSM은 대부분의 다른 유형의 현미경과 다르며 개념적으로 매우 복잡하지만 3단계로 간단하게 나누어 보겠습니다.
1. 광자 생산
공 초점 레이저 스캐닝 현미경은 기존의 광학 현미경을 기반으로 하지만 램프 대신 레이저 빔이 시료에 집중됩니다.
레이저 광의 강도는 중성 밀도 필터로 조정되어 매우 정확하고 빠르게 움직일 수 있는 스캐닝 거울 세트로 전달됩니다.
하나의 거울은 빔을 X 방향으로 기울이고 다른 거울은 Y 방향으로 함께 기울여 래스터 방식으로 빔을 기울입니다.
그런 다음 빔은 대물렌즈의 후면 초점면으로 이동하여 샘플에 초점을 맞춘 후, 샘플이 형광성인 경우 빛의 일부가 대물렌즈로 다시 전달됩니다.
이 빛은 레이저가 이동하는 것과 동일한 경로를 통해 다시 이동하고, 이 빛에 대한 스캐닝 거울의 효과는 스캐닝 중이 아닌 정지된 빛의 반점을 생성합니다.
2. 샘플 스캔
그런 다음 이 빛은 레이저에서 감지 시스템 쪽으로 반사되는 반투명 거울을 통과합니다.
검출 시스템의 첫 번째 물체는 현미경의 중간 이미지 평면에 있는 핀홀 조리개입니다.
이는 빛의 작은 중앙 부분만 광 검출기로 통과하도록 허용하며, 이 빛이 샘플 형광에서 비롯된 경우 레이저 빛과 다른 색상이 되며 방출 필터를 사용하여 샘플에서 반사된 레이저 빛과 이를 분리합니다.
반사된 빛을 검사하는 경우 초기 레이저 빛과 편광 각도가 다른 레이저 빛만 통과시키는 편광판을 통과하게 되기 때문에 형광과 반사된 레이저 광이 분리됩니다.
3. 광증배
CLSM의 광학 시스템에서 나오는 모든 빛은 강도가 매우 낮을 수 있으므로 광전자 증배관(PMT)은 이 광 신호를 감지하고 증폭하는 데 사용됩니다.
광전자 증배관은 잡음을 발생시키지 않고 희미한 신호를 약 백만 배 증폭할 수 있으며, PMT의 출력은 초기 광도에 비례하는 진폭을 갖는 전기 신호입니다.
이 아날로그 전기 신호는 컴퓨터의 아날로그-디지털 변환기에 의해 일련의 디지털 숫자로 변환됩니다.
또한, 레이저 빔이 표본을 따라 이동함에 따라 감지 시스템은 PMT 출력을 지속적으로 샘플링 및 변환하여 컴퓨터 모니터에 올바른 순서로 표시합니다.
이 복잡한 단계는 모두 너무 빠르게 진행되어 디스플레이가 샘플의 실시간 이미지를 보여주는 것처럼 보이게 됩니다.
Ⅴ. CLSM의 구성요소
이제 우리는 공초점 레이저 스캐닝 현미경이 어떻게 작동하는지 알았습니다. CLSM의 기본 회로도는 아래 그림을 확인하세요.
1. 레이저
레이저 광자는 CLSM 실험에서 형광단을 조명하는 데 사용되며, 레이저 라인은 선택 장치를 통해 선택하고 샘플에서 발견된 형광단과 일치시켜 실험에 사용할 수 있습니다.
2. 빔 스플리터
이 필터는 샘플 형광에서 방출되는 빛에서 여기 레이저 빛을 분리하여 샘플에서 나오는 빛을 보거나 감지할 수 있도록 합니다.
3. 스캐너
초점이 맞춰진 레이저 빔을 샘플 표본 전체에 걸쳐 픽셀 단위, 라인 단위, 왼쪽에서 오른쪽으로 안내하는 두 개 이상의 거울을 기반으로 합니다(래스터 스캐닝).
4. 대물렌즈
이는 현미경의 핵심이며 주로 광학 이미지 형성과 현미경의 해상도 한계를 결정합니다.
5. Z 제어
3D 이미지를 구성할 수 있는 CLSM의 핵심 구성 요소 중 하나입니다.
이를 통해 시료 내의 모든 초점면에 초점을 맞출 수 있으며, 전동식 Z-스테퍼를 사용하면 시료의 축 방향(수평면에 수직)으로 정밀한(>10nm) 단계 이동이 가능합니다.
6. 핀홀
중간 이미지 평면에서 조정 가능한 조리개입니다.
획득된 이미지에서 초점이 맞지 않는 빛의 대부분을 제외하여 광학적 분할 기능을 제공하며, 이는 광학 슬라이스의 두께를 정의하며 대물렌즈의 속성에 따라 달라집니다.
핀홀 크기는 컴퓨터의 소프트웨어를 통해 설정할 수 있으며, 빛 수집 효율성과 광학 절편 간의 가장 좋은 절충안은 1 Airy 단위로 설정된 경우입니다.
7. 광전 증배관
이 고감도 검출기는 샘플에서 방출되는 광자를 수집하며 기본적으로 빛 신호를 컴퓨터에 의해 기록되는 전기 신호로 변환합니다.
Ⅵ. 요약
보시다시피, 공 초점 레이저 스캐닝 현미경은 표면 아래에서 많은 일이 일어나는 복잡한 기술입니다.
화면에 표시되는 이미지를 제공하기 위해 다양한 프로세스가 빠르게 진행되고 있지만, 이제 우리는 레이저 광을 사용하여 샘플이 형광을 발하도록 유도하는 방법, 2D 현미경 사진에서 3D 이미지를 구축하는 방법, 그리고 이 모든 것을 가능하게 하는 구성 요소를 알고 있습니다.
만약, 다양한 기능을 모두 사용하는 방법을 익힌다면 아마도 만들 수 있는 이미지와 데이터는 끝이 없을 것입니다.